Kamikaze!
Randy Olliver nem egészen Fendrik dr. módszerét ajánlja, miként olvashatta. A nemzetközi norma szerint 60 méhegyed/család vizsgálatát írják elő. Mindezek ellenére én a családonkénti 10 idős méh vizsgálatát is elegendőnek tartom a házi vizsgálathoz, ha jó a mintavétel, bár a nagyobb mintaszám valóban jobb statisztikai adatot biztosít, lévén minél nagyobb a mintaszám, annál kisebb a véletlen hiba lehetősége. Csak kizárólag gyűjtő kijáró méheket, (idősebb egyedeket) érdemes vizsgálni. Én is a kijáróból javasolnám gyűjteni őket, az általam használt gyűjtőeszköz egy egyszerű -entomológusok által használt- "rovarszippantó". Azzal pillanatok alatt össze lehet szipkázni akár hatvan egyed méhet is...
Nem javasolom a teljes méh-egyed zúzással végzett vizsgálatát, túl sok törmelék nehezíti a vizsgálatot, a házi "tisztítás" pedig nehézkes. Az élő méhek leölése után az emésztőtraktus kihúzásával olyan vizsgálati anyaghoz juthatunk, mely a spóraszám tekintetében reprezentatív, de kiküszöböli a törmelék és egyéb "szennyező anyagok (virágpor-szemcsék, egyéb szövetrészek, sejtalkotók). Ehhez a kihúzott emésztőcsatorna bőséggel elegendő, a "homogenizálás", macerálás is jobb hatásfokú, kevesebb "törmelékkel" jár.
A vizsgálat lényege, hogy a szuszpenziót méh-egyedenként 1 ml bideszt-vízzel készítse (kivéve az immerziós lencsével folytatott számlálást, lásd később). Ez a gyakorlatban úgy fest, hogy méh-egyedenként pár ml vízzel készítse a szuszpenziót, azaz macerálja szét a mintát (nézetem szerint kizárólag a béltraktusból), majd a maceráló, szuszpendáló edényt többször öblítse át a mintavevő üvegbe (10 méhegyedes minta esetén a maceráló és öblítő folyadék összesen 10 ml). Ha maradt volna darabos törmelék a mintában, azt feltétlenül távolítsa el. Vannak, akik szűrik is a mintát, de ez már lehet torzító tényező is. A mintát akár kézzel, akár rázógéppel sokáig kell rázni, hogy a spórák homogén módon oszoljanak el a szuszpenzióban.
Ha jól és a statisztikai módszereknek megfelelő mintát készített, akkor következhet a minta számlálása. Ha pontos adatokat kíván kapni, akkor kénytelen lesz valamelyik számlálókamrás módszerhez folyamodni. Az "egy csepp" mértékegységet és az azt követő fedőlemezes lezárást nem tekintem egzakt számlálási módszernek, senki nem képes megmondani, milyen folyadékmennyiségben találhatók a megszámlált spórák, ergo a végeredményre nézve sem kap még tájékoztató adatot sem). Mi a mikrobiológiai gyakorlatban részecske- (sejt, spóra, stb) számlálással igyekeztünk korrekt adatokhoz jutni, annak pedig vannak szakmai szabályai is. Nincs ez másképp a Nosema-spórák házi számlálása esetében sem...
A számlálásra egy speciális tárgylemez-típus (= számlálókamra) szolgál, melynél a számlálókamra esetében egy pontosan kalibrált térfogatú folyadékteret alakítottak ki. A folyadékkamra alatt négyzetrács található. A folyadékteret a vizsgálandó szuszpenzióval töltik meg, s vékony fedőlemezzel buborékmentesen fedik. A folyadékkamrában pontosan kalibrált szuszpenzió-mennyiség fér el: a Thoma-féle sejt- és spóraszámláló kamra esetében a folyadéktér mélysége pontosan 0,1 mm mélységű, A négyzetrács egyes négyzeteinek alapterülete 0,0025 mm2. Ez alapján a négyzetek felett 0,0025x0,1=0,00025 mm3 szuszpenzió lesz a folyadéktér precíz lefedése után. A számlálás akkor pontos, ha egy-egy négyzet átlagosan 5-6 spórát tartalmaz, azaz a megszámolt 100 négyzet 500-600 spórát tartalmaz csak. Ha a szuszpenzió "sűrűbb", tehát több sejtet, spórát tartalmazna, akkor a mintát hígítani kell.
Az egy négyzetre eső spóraszám középértékét meg kell szorozni 4 millióval, s rögvest megkapjuk az egy ml-re, azaz egy méhegyedre eső spóraszámot. Ha hígítottuk a mintát, akkor természetesen a hígításnak megfelelően kell tovább szoroznunk , hogy a megfelelő spóraszámot kapjuk.
Másik sejtszámláló eszköz lehet a Bürker kamra, melynek alapelve ugyanaz, mint az előbbié, ennél is 0,1 mm a folyadékkamra mélysége, de a folyadékkamra két részre van osztva, két négyzetrácsot képeztek ott ki. Az egyik folyadékkamra négyzetrácsának beosztása azonos a Thoma-féle számlálókamráéval, a másik nagyobb beosztású, annál a folyadékkamrában 1-1 négyzet felett 0,004 mm3 szuszpenzió helyezkedik el. A nagyobbik négyzetrácsra eső átlagos számolt spóraszámot 250 000-rel kell szoroznunk, míg a másik folyadéktér esetében a Thoma-kamráéhoz hasonlóan 4 millio a szorzószám. A fedőlemez közös.
Van még nagyon sok, hasonló típusú számlálókamra, de azokat nem szokás a nagyobb méretű mikroorganizmusok, spórák számlálására használni, lévén sokkal "finomabb" munkára valók.
Az idézett linken Randy Oliver a haemacitométert és az azzal történő spóraszámlálást ismerteti. A vérsejtszámlálóval végzett számlálás esetében a szuszpenzióból 0,01 ml mennyiséget fogad be a számlálókamra. Mind az öt , három vonallal körülvett részben meg kell számolni a spórákat (mindegyik négyzet 16 kis négyzetet tartalmaz). Csak a felső- és bal oldali hármas vonalat érintő spórákat kell számolni, a jobb oldali és az alsó hármas vonalakat érintő spórákat nem számolják.
A méhenkénti spóraszám = ((az 1+2+3+4+5-ödik négyzetben számlált spóraszám)/80)x(4x106)
Ha nincs számlálókamrája, a minta készítésének helyes elvégzése után (1 ml/ méh-egyed) csak egy "kalibrált" kacsra van szüksége (laboratóriumi felszereléseket forgalmazó boltokban régen beszerezhető volt), mely 0,01 ml szuszpenziót képes a tárgylemezre juttatni (használata gyakorlatot igényel). Fedés után a számlálás a négyzetrács híján ugyan nehezebben, de elvégezhető. A teljes fedőlemez alatti spóramennyiséget kell számolni, túl nagy sűrűség esetén ez esetben is hígításra van szükség. A végén káprázik a számláló szeme, tehát érdemes számlálókamrával dolgozni, mert az otthoni elkészítése nem lehetséges.
Lehet vásárolni a spóraszámláláshoz automata vérsejtszámláló készüléket is (az árát ne kérdezze...!), a laborok pedig turbidimetriával is határoznak meg részecskeszámot, melynek során a fényelnyelés adataiból kalibrációs görbe segítségével következtetnek a részecske-sűrűségre, de úgy vélem, házi használatra a mikroszkópos spóraszámlálás bőven elégséges és jó módszerrel pontos tájékoztató adatokkal szolgál a Nosema-spórák mennyiségének diagnosztizálásához. Az értékeléshez kitűnő mankó az idézett cikk mennyiségi alapon nyugvó értékelése.
Az "egy méhből" elvégzett spóraszámlálást semmiképpen nem javasolnám, a mintavételi véletlen hiba nagyságrendje a vizsgálatot értékelhetetlenné tenné. A házi módszerhez legalább 10 méh/ család ( a nagyobb mintaszám pontosabb eredményt ad), méh-egyedenként 1 ml szuszpendáló folyadékban . Azért nem vizet írtam, mert az immerziós olaj használata esetén a szuszpendáló folyadéknak is immerziós folyadéknak illik lennie, kiküszöbölni szándékozván az immerziós folyadék és a víz eltérő törésmutatójából adódó hibákat.
Azt pedig senkinek ne higgye el, hogy morfológiai úton a mézelő méheket sújtó két Nosema-faj bármilyen fénymikroszkóppal biztonságosa szétválasztható lenne. Ez a városi legendák körébe tartozó megállapítás.